專利名稱：：黃芩素提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種傳統(tǒng)中藥中的有效成分提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用，具體為中藥黃芩中的黃芩素提取物在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：中藥黃芩別名山茶根、黃芩茶、黃金條根，為唇形科(Labiatae)黃芩屬(Scutellaria)多年生草本植物黃吝(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，始載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，藥用歷史悠久，歷代本草均有記載，是我國大宗中藥材之一。其性寒味苦，歸肺、膽、胃、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血，安胎等功效。黃芩同科植物有滇黃芩、粘毛黃芩、麗江黃芩，同屬植物有甘肅黃芩及川黃芩。黃酮類化合物是黃芩的主要化學(xué)成分，目前已分離出四十多種，包括黃芩素(baicalein)、黃芩苷(baicalin)、漢黃吝素(wogonin)、漢黃吝苷(wogonoside)、千層紙素A(oroxylin_A)、白楊黃素(chrysin)、千層紙素A-7-0-葡萄糖醛酸苷(oroxylin-A-7-glucuronide)、黃吝新素I、11(skullcapflavone)、二氫黃吝苷(dihydrobaicalin)等，前四種為其最主要的活性成分。還有14種氨基酸、揮發(fā)油、豆甾醇和黃芩酶等。黃酮類成分是其發(fā)揮藥理活性的基礎(chǔ)，現(xiàn)代藥理研究表明黃吝及其黃酮類成份(黃吝素、黃吝苷、漢黃吝素等)具有抗微生物、抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)，低劑量增強(qiáng)免疫功能、高劑量抑制免疫功能，降血壓，降血脂，利尿，抗血小板聚集和抗凝，抗氧化及中樞鎮(zhèn)靜解熱等作用。黃芩素(Baicalein)，異名黃芩苷元，黃芩黃素，是從黃芩的干燥根中提取出來的有效成分之一，在生藥中占(ratioinofrawmaterial)5.41%。黃芩素的醇提物為黃色針狀晶體，分子量(麗)270.3，分子式為QA化，分子結(jié)構(gòu)為5，6，7-三羥基黃酮，其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于黃酮類。研究表明黃芩素具有抗炎抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化清除氧自由基、抗菌抗病毒、抗腫瘤、抗凝抗血栓形成、保護(hù)心腦血管和神經(jīng)、抗焦慮等多種藥理作用，最近研究表明其對糖尿病晚期腎臟發(fā)生纖維化樣病變具有一定的防治作用。目前，臨床上主要用黃芩素的抗炎和抗菌作用。月市(間質(zhì))纖維化(Pulmonaryfibrosis,PF)又稱肺間質(zhì)疾病(interstitiall皿gdisease,IU))，或彌漫性月市實(shí)質(zhì)疾病(diggeseparenchymall皿gdisease，DPU))，是以彌漫性的肺泡炎、肺間質(zhì)炎癥和間質(zhì)纖維化為組織學(xué)特點(diǎn)的一組疾病群，涵蓋的疾病有180多種，多數(shù)疾病缺乏有效的治療手段，預(yù)后極差。因此，該組疾病目前引起世界呼吸病學(xué)屆的重視。目前，對肺纖維化的臨床研究主要集中在特發(fā)性間質(zhì)肺纖維化(idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF)方面，因其進(jìn)展快、死亡率高而被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為肺系疑難疾病，也是遍及全世界的疾病。IPF確診后平均存活期為2-4年，5年生存率50-70%。肺纖維化的病理特點(diǎn)主要是長期肺部炎癥導(dǎo)致肺泡持續(xù)性損傷，肺內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的大量沉積和廣泛的肺實(shí)質(zhì)重建。各種因素?fù)p傷肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞后，均可引起肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，炎癥細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子介導(dǎo)了早期的肺損傷，損傷的存在和反復(fù)而改變肺組織微環(huán)境，特別是肺泡腔，從而導(dǎo)致修復(fù)程序的失調(diào)，最終形成肺纖維化。成纖維細(xì)胞參與人體各種組織和器官的損傷、修復(fù)和再生等過程，生理情況下肺成纖維細(xì)胞的生長存在精確的調(diào)控，肺內(nèi)膠原的合成與降解處于平衡狀態(tài)。肺成纖維細(xì)胞在各種因素所致的慢性肺間質(zhì)纖維化形成過程中發(fā)揮著重要的作用。肺成纖維細(xì)胞的異常增殖及向肺肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是IPF的主要特征。膠原纖維是ECM的重要組成部分，其生化成份是膠原蛋白(collagen,簡稱膠原)。羥脯氨酸(hydro鄧roline，HYP)是機(jī)體膠原蛋白的主要成分之一，約占其氨基酸總量的13.4X，組織中HYP含量可作為其膠原組織代謝、衡量膠原含量及反映間質(zhì)膠原纖維沉積的重要指標(biāo)。近年來，自由基損傷、脂質(zhì)過氧化成為肺纖維化的熱點(diǎn)之一。正常情況下，肺的抗氧化能力與機(jī)體不斷產(chǎn)生自由基的氧化能力之間處于動態(tài)平衡。研究證實(shí)，超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，SOD活性高低直接反映了機(jī)體清除自由基的能力。機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化物，如醛基(丙二醛malondialdehyde，MDA)、酮基、羥基('0H)、新的自由基等。因此，體內(nèi)MDA的含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度。機(jī)體氧化應(yīng)激存在時，通過一氧化氮合酶(N0S)形成一氧化氮(NO)，可與超氧陰離子結(jié)合，形成過氧亞硝酸鹽陰離子(0N00-)，從而產(chǎn)生肺毒性。眾多研究結(jié)果證實(shí)，與其他器官纖維化一樣，肺纖維化是ECM過度沉積的過程，涉及到細(xì)胞、細(xì)胞因子、ECM等因素的相互作用，信號分子途徑之間可能相互影響，存在多條旁路途徑。因此，肺纖維化是多種因素、多個環(huán)節(jié)參與的緩慢的錯綜復(fù)雜的過程，目前尚缺乏特異有效的防治肺纖維化的藥物。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，在慢性肺纖維化疾病的治療中顯示了一定的優(yōu)勢。目前發(fā)現(xiàn)，對肺纖維化有一定治療效果的中藥研究主要集中于(l).抗自由基損傷；(2).抑制炎癥因子的釋放，發(fā)揮抗炎性損傷作用；(3).影響膠原代謝過程，從而減少纖維蛋白形成；(4).影響機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，降低應(yīng)激效應(yīng)程度(楊裙，潘強(qiáng)，王世嶺，等。中國藥業(yè)，2004，13(8):21-24)。鑒于黃芩素提取物具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗菌抗病毒等多方面的藥理作用，且至今尚未見有應(yīng)用黃芩素提取物防治肺纖維化疾病的報道，因此本發(fā)明人研究了黃芩素提取物對BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠動物模型是否具有防治作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是研究傳統(tǒng)中藥黃芩的黃芩素提取物在制備抗肺纖維化藥物中的應(yīng)用，尤其是從中藥中提取分離防治肺纖維化的有效成份，以便制備療效好、毒副作用小、價格低廉、服用方便，可長期使用的抗肺纖維化藥物。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案黃芩素提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案是通過氣管內(nèi)注入博萊霉素(Bleomycin,BLM)制備小鼠肺纖維化動物模型，該模型的病理過程與人類特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)相似，作為肺纖維化的經(jīng)典動物模型而被廣泛應(yīng)用。本發(fā)明首次選用黃芩素提取物作為治療藥物，研究黃芩素提取物對BLM誘導(dǎo)肺纖維化動物肺組織、血清相關(guān)生化指標(biāo)及病理形態(tài)學(xué)的影響，觀察黃芩素提取物對肺纖維化動物模型的防治作用，從而為黃芩素提取物防治肺纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本發(fā)明所用黃吝素提取物中黃吝素含量^50%(批號090429)，由本所植化室參考現(xiàn)有技術(shù)從黃芩根中提取而得，所用中藥材黃芩購自河北安國市新東方藥業(yè)有限責(zé)任公司，黃芩素提取物也可由商業(yè)購得。本發(fā)明人在研究中藥抗肺阻塞性疾病的過程中，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中藥黃芩中的黃芩素提取物(黃芩素含量^50%)給藥28天后可使博萊霉素(BLM)誘導(dǎo)肺纖維化小鼠的體重明顯增加(P〈0.01)，并可明顯降低小鼠肺系數(shù)(P<0.05，P<0.01)(實(shí)施例1);其血清和肺組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性增強(qiáng)或明顯增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)，脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量減少或明顯減少(P<0.05，P<0.01)(實(shí)施例2、3);血清抑制羥自由基能力(*OH)明顯增強(qiáng)(P<0.01)(實(shí)施例2)，肺組織總抗氧化能力(T-AOC)增強(qiáng)或明顯增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)(實(shí)施例3)。肺組織抑制羥自由基(OH)能力增強(qiáng)(P<0.05)(實(shí)施例4)，而總一氧化氮合酶(T-NOS)活性降低(P<0.05)(實(shí)施例4)。肺組織中可間接反映膠原含量的羥脯氨酸(HYP)含量明顯減少(P<0.01)(實(shí)施例5)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，黃芩素提取物可減輕或明顯減輕肺纖維化小鼠的肺泡炎程度(P<0.05，P<0.01)及減輕或明顯減輕肺纖維化程度(P<0.05，P<0.01)(實(shí)施例6)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明黃芩素提取物具有防治肺纖維化作用，具體體現(xiàn)為增加肺纖維化小鼠體重，降低肺系數(shù)，減輕肺泡炎程度和肺間質(zhì)纖維化程度。其作用機(jī)制涉及抗炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)機(jī)體抗脂質(zhì)過氧化能力、抑制羥自由基產(chǎn)生、增強(qiáng)氧自由基清除、抑制細(xì)胞間質(zhì)膠原生成、沉積及成纖維細(xì)胞增殖等方面。由鑒于此，按本發(fā)明所制備的黃芩素提取物有可能作為潛在的侯選藥物，被用于肺阻塞性疾病，特別是肺纖維化的預(yù)防和治療。因此，本發(fā)明的目的是提供一種傳統(tǒng)中藥黃芩中的黃芩素提取物用于防治肺阻塞性疾病，特別是在肺纖維化疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個目的是提供含有本發(fā)明制備的黃芩素提取物，及一種或多種原藥上可接受的載體和/或賦形劑的藥物。本發(fā)明的藥物除含有本發(fā)明制備的黃芩素提取物外，還可含有一種或多種具有相同或相似作用的其他天然或化學(xué)合成的活性成分?？梢园凑展ぷ髦幸阎姆椒▽⒈景l(fā)明的藥物制成片劑、膠囊劑、丸劑、粉末劑、栓劑、膏劑及溶液劑和懸浮劑。其中優(yōu)選的是適用于胃腸道給藥的膠囊劑和片劑。在制備適用于口服給藥的膠囊劑、片齊U、丸劑和粉末劑時，可以使用蔗糖、乳糖、玉米淀粉、微晶纖維素、羧甲基纖維素作為載體或賦形劑。此外，也可以使用制藥工業(yè)中已知的方法和輔助成分將本發(fā)明的藥物制成適于口服給藥的溶液劑和懸浮劑。為了制備適于胃腸道外途徑給藥的溶液劑或懸浮劑，可以使用蒸餾水、注射用水、等滲氯化鈉溶液或葡萄糖溶液，或者低濃度(例如l-100mM)磷酸鹽緩沖液(PBS)作為載體或稀釋劑。可以在這些胃腸道外給藥的制劑中加入一種或多種其他輔助成分或添加劑，例如可使用抗壞血酸作為抗氧化劑，使用苯甲酸鈉等作為防腐劑。在這些劑型中還可以含有其他適當(dāng)?shù)脑鋈軇?、崩解劑、潤滑劑、著色劑、分散劑或表面活性劑?！阏f來，本發(fā)明藥物組合物的臨床口服給藥劑量為0.l-100mg/Kg體重/天，較好為O.l-50mg/Kg體重/天，最好為l-10mg/Kg體重/天。然而，更確切的用藥劑量應(yīng)根據(jù)待治療的疾病或病例狀況性質(zhì)、嚴(yán)重程度、患者的年齡、體重、待治療患者對所用藥的敏感性及給藥方式等因素由臨床醫(yī)生決定。本發(fā)明基于中藥黃芩中的黃芩素提取物組成的藥物，有效成分單一，療效確切，使用方便，可廣泛應(yīng)用于制備防治肺纖維化及相關(guān)疾病的藥物中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.本發(fā)明首次將傳統(tǒng)中藥黃芩的有效成分——黃芩素提取物應(yīng)用于經(jīng)典而被廣泛應(yīng)用的肺纖維化動物模型，進(jìn)行防治肺纖維化的實(shí)驗(yàn)研究。2.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)黃芩素提取物可明顯增加模型小鼠的體重，同時明顯降低模型小鼠的肺系數(shù)，并可有效地減輕肺組織的肺泡炎和肺纖維化程度，提示黃芩素提取物具有一定的防治肺纖維化作用。3.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)黃芩素提取物的抗纖維化作用機(jī)制與其抗炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化作用、減少羥自由基產(chǎn)生、增強(qiáng)氧自由基清除、抑制膠原生成及成纖維細(xì)胞增殖有關(guān)。4.黃芩藥材來源豐富、價格低廉，黃芩素提取工藝成熟、藥理作用廣、療效確切、服用方便，可長期服用。下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述附圖為黃芩素提取物對博萊霉素致小鼠肺纖維化影響的病理觀察結(jié)果(HEX100)圖1為正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔透亮，肺泡壁完整，肺泡間隔未見增厚及炎細(xì)胞浸潤。圖2為模型組；肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔變窄或消失，肺泡間隔顯著增厚，肺間質(zhì)大量成纖維細(xì)胞增生和膠原纖維沉積，大量炎細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)纖維化形成。圖3為黃芩素提取物小劑量組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，有較少纖維化病灶，病灶周圍炎細(xì)胞浸潤，肺泡壁輕度增厚，肺泡間隔成纖維細(xì)胞較多，較多炎細(xì)胞浸潤，肺纖維化程度輕。圖4為黃芩素提取物中劑量組肺組織結(jié)構(gòu)輕度破壞，肺泡壁輕度增厚，肺泡間隔成纖維細(xì)胞輕度增多，少量炎細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)纖維化程度較輕。圖5為黃吝素提取物大劑量組組肺泡結(jié)構(gòu)較完整清晰，肺泡壁輕度增厚，肺泡間隔成纖維細(xì)胞較少，少量炎性細(xì)胞浸潤，肺間隔纖維化程度不明顯。圖6為陽性對照藥醋酸潑尼松組肺泡結(jié)構(gòu)較清晰，可見較少纖維化病灶，少量炎細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚，纖維化程度較模型組輕。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例證明，而不是限制本發(fā)明。在不違背本發(fā)明的精神和原則前提下，對本發(fā)明的技術(shù)步驟進(jìn)行的任何改動和改變都將落入本發(fā)明待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。實(shí)施例11.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察黃芩素提取物對BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠體重及肺系數(shù)的影響1.2實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動物昆明種小鼠，90只，雌雄兼有，體重18-22克，清潔級，由蘇州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2007-0007，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證SYXK(蘇)2007-0035。試驗(yàn)期間飼養(yǎng)室溫度20±3.2。C，相對濕度為55±10%。試驗(yàn)藥物黃吝素提取物，黃吝素含量為^50%，棕黃色結(jié)晶，批號090429，由本所植化室從黃芩根中提取而得，4t:冰箱保存。臨用加5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)制成混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配；博萊霉素A5(BLMA5)，白色凍干粉末，15mg/支，日本化藥株式會社生產(chǎn)，批號880990，進(jìn)口藥品注冊證號H20040205;注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H13020657;4%水合氯醛；醋酸潑尼松片，5mg/片，江蘇徐州平光制藥有限責(zé)任公司，批號32022681。儀器電子天平，PL203型，美國梅特勒-托利多公司生產(chǎn)；1.3實(shí)驗(yàn)方法動物分組昆明種小鼠，90只，雌雄兼有，體重18-22克，按性別體重隨機(jī)分為6組，即正常對照組、模型組、黃吝素提取物大(200mg/kg/d)、中(100mg/kg/d)及小劑量組(50mg/kg/d)和陽性對照藥醋酸潑尼松組(6.67mg/kg/d)，每組小鼠15只。模型制備模型組與各治療組小鼠采用BLM復(fù)制肺纖維化動物模型。具體操作步驟如下實(shí)驗(yàn)時，小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰臥手術(shù)臺，固定頭部及四肢，常規(guī)消毒，無菌條件下行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，lml注射器剌入模型組、黃芩素提取物各治療組及醋酸潑尼松組小鼠氣管軟骨環(huán)間隙緩慢注入BLMA5(5mg/kg體重)，正常對照組在相同條件下注入等體積生理鹽水。注藥后立即將小鼠直立，沿身體縱軸左右旋轉(zhuǎn)3-5min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)，然后縫合皮膚、消毒，待小鼠清醒后送清潔級觀察室常規(guī)飼養(yǎng)。整個手術(shù)過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則。術(shù)前1天及術(shù)后3天所有實(shí)驗(yàn)小鼠均連續(xù)肌肉注80萬單位青霉素鈉(0.lml/只/天)。給藥方案各組動物經(jīng)博萊霉素造模后，第二天開始按照相應(yīng)的體重灌服給藥，正常對照組及模型組給予相應(yīng)體積5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，各治療組分別給予不同劑量的黃芩素提取物及陽性對照藥潑尼松。每隔一天小鼠稱重一次，連續(xù)給藥28天。小鼠稱重及肺系數(shù)測定各組小鼠處理前12小時禁食不禁水，處理當(dāng)日小鼠稱體重，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組動物的平均體重作為觀察指標(biāo)。無菌條件下開胸分離出氣管和兩側(cè)肺臟，冰生理鹽水清洗去除肺臟表面污漬后準(zhǔn)確稱取肺重。按以下公式計(jì)算肺系數(shù)，肺系數(shù)=肺重(ng)/體重(g)。鑒于肺纖維化病程早期主要是肺間質(zhì)及肺泡腔炎性細(xì)胞浸潤及大量炎性細(xì)胞滲出，晚期肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞大量增生，膠原過度沉積等均可導(dǎo)致肺系數(shù)增加，因此肺系數(shù)這一指標(biāo)可間接反應(yīng)肺纖維化小鼠的肺泡炎癥和肺纖維化的程度。1.4統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以^士s表示，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)比較組間差異性，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果模型組小鼠體重較正常對照組明顯降低(P<O.Ol)，與模型組相比，黃芩素提取物各劑量組小鼠體重明顯增加(P<0.01)，中、小劑量組小鼠的肺系數(shù)降低(P<0.05)，大劑量組小鼠的肺系數(shù)明顯降低(P<0.01);醋酸潑尼松組小鼠體重呈增加趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P>0.05)，肺系數(shù)亦降低，(P<0.05)，見表1。表1黃芩素提取物對BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠體重、肺系數(shù)的影響(x±sn=15)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>##P<0.Olvscontrol;*P<0.05，**P<0.Olvsmodel.1.6結(jié)論模型組小鼠體重明顯降低，肺系數(shù)明顯增加；黃芩素提取物可明顯增加肺纖維化小鼠的體重，并不同程度地降低肺系數(shù)。陽性藥醋酸潑尼松可降低小鼠肺系數(shù)，體重增加不明顯。上述結(jié)果提示黃芩素提取物可增加肺纖維化小鼠體重，且可降低肺系數(shù)，具有一定的防治肺纖維化作用。實(shí)施例22.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察黃吝素提取物對BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠血清SOD活性、MDA含量及抑制，0H能力的影響2.2實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動物昆明種小鼠，90只，雌雄兼有，體重18-22克，清潔級，由蘇州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2007-0007，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK(蘇)2007-0035。試驗(yàn)期間飼養(yǎng)室溫度20±3.2。C，相對濕度為55±10%。試驗(yàn)藥物黃吝素提取物，黃吝素含量為^50%，棕黃色結(jié)晶，批號090429，由本所植化室從黃芩根中提取而得，4t:冰箱保存。臨用加5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)制成混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配；博萊霉素A5(BLMA5)，白色凍干粉末，15mg/支，日本化藥株式會社生產(chǎn)，批號880990，進(jìn)口藥品注冊證號H20040205;注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H13020657;4%水合氯醛；醋酸潑尼松片，5mg/片，江蘇徐州平光制藥有限責(zé)任公司，批號32022681。試劑與儀器超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)及羥自由基(OH)，檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號20090529;紫外可見分光光度計(jì)，T6新世紀(jì)型，為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)，儀器編號18-1650-01-016;高速低溫冷凍離心機(jī)，5417R型，德國艾本德股份公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋，H.H.S6型，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司出品。2.3試驗(yàn)方法動物分組昆明種小鼠，90只，雌雄兼有，體重18-22克，按性別體重隨機(jī)分為6組，即正常對照組、模型組、黃吝素提取物大(200mg/kg/d)、中(100mg/kg/d)及小劑量組(50mg/kg/d)和陽性對照藥醋酸潑尼松組(6.67mg/kg/d)，每組小鼠15只。模型制備模型組與各治療組小鼠采用BLM復(fù)制動物肺纖維化模型。具體操作步驟如下實(shí)驗(yàn)時，小鼠用4%的水合氯醛(O.Olml/g)腹腔注射麻醉，仰臥手術(shù)臺，固定頭部及四肢，常規(guī)消毒，無菌條件下行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，lml注射器剌入模型組、黃芩素提取物各治療組及醋酸潑尼松組小鼠氣管軟骨環(huán)間隙緩慢注入BLMA5(5mg/kg體重)，正常對照組在相同條件下注入等體積生理鹽水。注藥后立即將小鼠直立，沿身體縱軸左右旋轉(zhuǎn)3-5min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)，然后縫合皮膚、消毒，待小鼠清醒后送清潔級觀察室常規(guī)飼養(yǎng)。整個手術(shù)過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則。術(shù)前l(fā)日及術(shù)后3天所有小鼠連續(xù)肌肉注射80萬單位青霉素鈉(0.lml/只/天)。給藥方案各組動物經(jīng)博萊霉素造模后，第二天開始按照相應(yīng)的體重灌服給藥，正常對照組及模型組給予相應(yīng)體積5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，各治療組分別給予不同劑量的黃芩素提取物及陽性對照藥潑尼松。每隔一天小鼠稱重一次，連續(xù)給藥28天。血清的制備各組小鼠眼眶靜脈取全血后3500r/min離心10min，小心取上清置于1.5ml離心管內(nèi)，轉(zhuǎn)移后的上清再次3500r/min離心10min。制備好的血清液-8(TC冰箱保存，以測定血清中SOD，MDA，和OH等生化指標(biāo)。生化指標(biāo)測定各組小鼠血清內(nèi)SOD，MDA和OH等各項(xiàng)生化指標(biāo)均按照相應(yīng)檢測試劑盒所要求的化學(xué)比色法進(jìn)行測定。2.4統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以^土s表示，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)比較組間差異性，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.5試驗(yàn)結(jié)果模型組小鼠與正常組相比，血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性及抑制羥自由基(OH)能力明顯降低，氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量明顯增加(P<0.01)。與模型組相比，黃芩素提取物各劑量組小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和抑制OH能力增強(qiáng)或明顯增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01);氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量則減少或明顯減少(P〈0.05，P〈0.01)，且呈量效趨勢。醋酸潑尼松組小鼠血清抑制羥自由基能力明顯增強(qiáng)(P<0.01)，丙二醛含量減少(P<0.05)，超氧化物歧化酶(SOD)活性增強(qiáng)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P>0.05)，見表2。表2黃吝素提取物對BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠血清SOD活性、MDA含量和抑制OH能力的影響(x士sn=l5)_;—劑量""15B~~抑制oh能力'(mg/kg/d)(U/ml)(腸l/ml)(U/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>##P<0.Olvscontrol;*P<0.05，**P<0.Olvsmodel.2.6結(jié)論經(jīng)博萊霉素造模28天后，模型組小鼠血清內(nèi)超氧化物岐化酶活性和抑制羥自由基能力明顯降低，而氧化代謝產(chǎn)物丙二醛的含量則明顯增加。黃芩素提取物各給藥組小鼠血清內(nèi)超氧化物岐化酶活性和抑制羥自由基能力明顯增強(qiáng)，丙二醛含量降低，呈量效趨勢。陽性藥醋酸潑尼松組小鼠血清中超氧化物岐化酶活性有增強(qiáng)趨勢，丙二醛含量減少，抑制羥自由基能力明顯增強(qiáng)。上述結(jié)果顯示黃芩素提取物可增強(qiáng)肺纖維化小鼠血清清除氧自由基能力，增強(qiáng)抑制羥自由基能力，并可降低體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度，有利于肺纖維化的防治。實(shí)施例33.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察黃吝素提取物對BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織SOD活性、MDA含量及T-AOC的影響3.2實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動物昆明種小鼠，90只，雌雄兼有，體重18-22克，清潔級，由蘇州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2007-0007，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK(蘇)2007-0035。試驗(yàn)期間飼養(yǎng)室溫度20±3.2"，相對濕度為55±10%。試驗(yàn)藥物黃吝素提取物，黃吝素含量為^50%，棕黃色結(jié)晶，批號090429，由本所植化室從黃芩根中提取而得，4t:冰箱保存。臨用加5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)制成混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配；博萊霉素A5(BLMA5)，白色凍干粉末，15mg/支，日本化藥株式會社生產(chǎn)，批號880990，進(jìn)口藥品注冊證號H20040205;注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H13020657;4%水合氯醛；醋酸潑尼松片，5mg/片，江蘇徐州平光制藥有限責(zé)任公司，批號32022681。試劑與儀器超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，總抗氧化能力(T-AOC)等各指標(biāo)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號20090529;紫外可見分光光度計(jì)，T6新世紀(jì)型，為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)，儀器編號18-1650-01-016;高速低溫冷凍離心機(jī)，5417R型，德國艾本德股份公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋，H.H.S6型，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司出品。3.3試驗(yàn)方法動物分組昆明種小鼠，90只，雌雄兼有，體重18-22克，按性別體重隨機(jī)分為6組，即正常對照組、模型組、黃吝素提取物大(200mg/kg/d)、中(100mg/kg/d)及小劑量組(50mg/kg/d)和陽性對照藥醋酸潑尼松組(6.67mg/kg/d)，每組小鼠15只。模型制備模型組與各治療組小鼠采用BLM復(fù)制動物肺纖維化模型。具體操作步驟如下實(shí)驗(yàn)時，小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰臥手術(shù)臺，固定頭部及四肢，常規(guī)消毒，無菌條件下行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，lml注射器剌入模型組、黃芩素提取物各治療組及醋酸潑尼松組小鼠氣管軟骨環(huán)間隙緩慢注入BLMA5(5mg/kg體重)，正常對照組在相同條件下注入等體積生理鹽水。注藥后立即將小鼠直立，沿身體縱軸左右旋轉(zhuǎn)3-5min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)，然后縫合皮膚、消毒，待小鼠清醒后送清潔級觀察室常規(guī)飼養(yǎng)。整個手術(shù)過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則。術(shù)前l(fā)日及術(shù)后3天所有小鼠連續(xù)肌肉注射80萬單位青霉素鈉(0.lml/只/天)。給藥方案各組動物經(jīng)博萊霉素造模后，第二天開始按照相應(yīng)的體重灌服給藥，正常對照組及模型組給予相應(yīng)體積5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，各治療組分別給予不同劑量的黃芩素提取物及陽性對照藥潑尼松。每隔一天小鼠稱重一次，連續(xù)給藥28天。肺組織勻漿的制備整個肺組織去除右下葉作病理切片和右側(cè)中葉測定羥脯氨酸含量外，其余肺組織準(zhǔn)確稱重，加入9倍肺組織質(zhì)量的冰生理鹽水，內(nèi)切式組織勻漿器制成10%的肺組織勻漿，-S(rC冰箱保存，用于測定S0D，MDA，T-AOC等各項(xiàng)生化指標(biāo)。生化指標(biāo)測定各組小鼠肺組織內(nèi)SOD，MDA和T-AOC等各項(xiàng)指標(biāo)均按照相應(yīng)生化指標(biāo)檢測試劑盒所要求的化學(xué)比色法進(jìn)行測定。3.4統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以^士s表示，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)比較組間差異性，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.5試驗(yàn)結(jié)果與正常組小鼠相比，模型組小鼠肺組織中超氧化物岐化酶(SOD)活性降低(P<0.05)，氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量明顯增加(P<0.01)，總抗氧化能力(T-AOC)降低(P<0.05)。與模型組相比，黃芩素提取物中、大劑量組小鼠肺組織SOD活性增強(qiáng)(P<0.05)，T-AOC增強(qiáng)或明顯增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)，黃吝素小劑量組小鼠肺組織SOD活性及T-AOC有增加趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，黃芩素提取物各劑量組肺組織中MDA含量明顯減少(P<0.01)。醋酸潑尼松組小鼠肺組織中SOD活性有增加趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，MDA含量減少(P<0.05)，T-AOC增強(qiáng)(P<0.05)，見表3。表3黃芩素提取物對BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠肺組織SOD活性、MDA含量和T_A0C的<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>#P<0.05，##P<0.Olvscontrol;承P<0.05，承承P<0.Olvsmodel3.6結(jié)論模型組小鼠肺組織內(nèi)超氧化物岐化酶活性和總抗氧化能力降低，而丙二醛含量明顯增加。給予黃芩素提取物可不同程度地提高各劑量組小鼠肺組織內(nèi)超氧化物岐化酶活性和總抗氧化能力，并可明顯減少各劑量組小鼠肺組織中氧化代謝產(chǎn)物丙二醛的含量。陽性藥醋酸潑尼松可增加肺組織內(nèi)總抗氧化能力，減少丙二醛的含量。上述結(jié)果顯示，黃芩素提取物可能通過增強(qiáng)小鼠肺組織清除氧自由基作用，降低脂質(zhì)過氧化作用及提高總抗氧化能力來實(shí)現(xiàn)其對BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠肺組織的保護(hù)作用。實(shí)施例44.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察黃吝素提取物對BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織抑制0H能力和T-NOS活性的影響4.2實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動物昆明種小鼠，90只，雌雄兼有，體重18-22克，清潔級，由蘇州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2007-0007，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK(蘇)2007-0035。試驗(yàn)期間飼養(yǎng)室溫度20±3.2"，相對濕度為55±10%。試驗(yàn)藥物黃吝素提取物，黃吝素含量為^50%，棕黃色結(jié)晶，批號090429，由本所植化室從黃芩根中提取而得，4t:冰箱保存。臨用加5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)制成混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配；博萊霉素A5(BLMA5)，白色凍干粉末，15mg/支，日本化藥株式會社生產(chǎn)，批號880990，進(jìn)口藥品注冊證號H20040205;注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H13020657;4%水合氯醛；醋酸潑尼松片，5mg/片，江蘇徐州平光制藥有限責(zé)任公司，批號32022681。試劑與儀器羥自由基(OH)，總一氧化氮合酶(T-NOS)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號20090529;紫外可見分光光度計(jì)，T6新世紀(jì)型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)，儀器編號18-1650-01-016;高速低溫冷凍離心機(jī)，5417R型，德國艾本德股份公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋，H.H.S6型，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司出品。4.3試驗(yàn)方法動物分組昆明種小鼠，90只，雌雄兼有，體重18-22克，按性別體重隨機(jī)分為6組，即正常對照組、模型組、黃吝素提取物大(200mg/kg/d)、中(100mg/kg/d)及小劑量組(50mg/kg/d)和陽性對照藥醋酸潑尼松組(6.67mg/kg/d)，每組小鼠15只。模型制備模型組與各治療組小鼠采用BLM復(fù)制動物肺纖維化模型。具體操作步驟如下實(shí)驗(yàn)時，小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰臥手術(shù)臺，固定頭部及四肢，常規(guī)消毒，無菌條件下行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，lml注射器剌入模型組、黃芩素提取物各治療組及醋酸潑尼松組小鼠氣管軟骨環(huán)間隙緩慢注入BLMA5(5mg/kg體重)，正常對照組在相同條件下注入等體積生理鹽水。注藥后立即將小鼠直立，沿身體縱軸左右旋轉(zhuǎn)3-5min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)，然后縫合皮膚、消毒，待小鼠清醒后送清潔級觀察室常規(guī)飼養(yǎng)。整個手術(shù)過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則。術(shù)前l(fā)日及術(shù)后3天所有小鼠連續(xù)肌肉注射80萬單位青霉素鈉(0.lml/只/天)。給藥方案各組動物經(jīng)博萊霉素造模后，第二天開始按照相應(yīng)的體重灌服給藥，正常對照組及模型組給予相應(yīng)體積5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，各治療組分別給予不同劑量的黃芩素提取物及陽性對照藥潑尼松。每隔一天小鼠稱重一次，連續(xù)給藥28天。肺組織勻漿的制備整個肺組織去除右下葉作病理切片和右側(cè)中葉測定羥脯氨酸含量外，其余肺組織準(zhǔn)確稱重，加入9倍肺組織質(zhì)量的冰生理鹽水，內(nèi)切式組織勻漿器制成10%的肺組織勻漿，-S(TC冰箱保存，以檢測OH和T-NOS等生化指標(biāo)。生化指標(biāo)測定各組小鼠肺組織內(nèi)OH和T-NOS等指標(biāo)均按照相應(yīng)的生化指標(biāo)檢測試劑盒所要求的化學(xué)比色法進(jìn)行測定。4.4統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以；士s表示，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)比較組間差異性，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.5試驗(yàn)結(jié)果模型組小鼠肺組織抑制羥自由基(OH)能力降低(P<0.05)，總一氧化氮合酶(T-NOS)活性明顯增強(qiáng)(P<0.01)。與模型組相比，黃芩素提取物中、大劑量組小鼠肺組織抑制OH能力增強(qiáng)(P<0.05)，而黃吝素提取物各劑量組T-NOS活性均降低(P<0.05)。醋酸潑尼松組小鼠肺組織內(nèi)T-NOS活性降低(P<0.05)，抑制OH能力呈增強(qiáng)趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，見表4。表4黃芩素提取物對BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠肺組織抑制*0H能力和T-NOS活性的影口向(x士sn=15)絎別劑量(呢/kg/d)0H(U/mgprot)T-N0S(U/mgprot)正常對照甜.93.02±15.540.212±0.026模糊82.07±10.72=0.250±0.042s1醋酸潑尼松組6.6790.36±19.750.223±0.033'黃^素提取物■、，5088.83±15.680.221±0.035*中劑輩鄰10089.36±丄2.17f0.224±0.041*人劑量幼.20092.51±17.65'0.215±0.037*#P<0.01，##P<0.Olvscontrol;*P<0.05vsmodel.4.6結(jié)論模型組小鼠與正常對照組相比，肺組織抑制羥自由基能力降低，總一氧化氮合酶活性明顯增強(qiáng)。黃芩素提取物中、大劑量組可增強(qiáng)肺纖維化小鼠肺組織抑制羥自由基的能力，且各劑量組均可降低肺組織中總一氧化氮合酶的活性。陽性藥醋酸潑尼松組小鼠肺組織抑制羥自由基能力有增強(qiáng)趨勢，總一氧化氮合酶的活性降低。由此提示黃芩素提取物對小鼠肺組織的保護(hù)作用可能與其抑制肺組織內(nèi)羥自由基的產(chǎn)生及降低總一氧化氮合酶活性從而減少一氧化氮的產(chǎn)生有關(guān)。實(shí)施例55.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察黃吝素提取物對BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織HYP含量的影響5.2實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動物昆明種小鼠，90只，雌雄兼有，體重18-22克，清潔級，由蘇州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2007-0007，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證SYXK(蘇)2007-0035。試驗(yàn)期間飼養(yǎng)室溫度20±3.2°C，相對濕度為55±10%。試驗(yàn)藥物黃芩素提取物，黃芩素含量為^50%，棕黃色結(jié)晶，批號090429，由本所植化室從黃芩根中提取而得，4t:冰箱保存。臨用加5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)制成混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配；博萊霉素A5(BLMA5)，白色凍干粉末，15mg/支，日本化藥株式會社生產(chǎn)，批號880990，進(jìn)口藥品注冊證號H20040205;注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H13020657;4%水合氯醛；醋酸潑尼松片，5mg/片，江蘇徐州平光制藥有限責(zé)任公司，批號32022681。試劑與儀器羥脯氨酸(HYP)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批號20090529;紫外可見分光光度計(jì)，T6新世紀(jì)型，為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)，儀器編號18-1650-01-016;高速低溫冷凍離心機(jī)，5417R型，德國艾本德股份公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋，H.H.S6型，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司出品。5.3試驗(yàn)方法動物分組昆明種小鼠，90只，雌雄兼有，體重18-22克，按性別體重隨機(jī)分為6組，即正常對照組、模型組、黃吝素提取物大(200mg/kg/d)、中(100mg/kg/d)及小劑量組(50mg/kg/d)和陽性對照藥醋酸潑尼松組(6.67mg/kg/d)，每組小鼠15只。模型制備模型組與各治療組小鼠采用BLM復(fù)制動物肺纖維化模型。具體操作步驟如下實(shí)驗(yàn)時，小鼠用4%的水合氯醛(O.Olml/g)腹腔注射麻醉，仰臥手術(shù)臺，固定頭部及四肢，常規(guī)消毒，無菌條件下行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，1ml注射器剌入模型組、黃芩素提取物各治療組及醋酸潑尼松組小鼠氣管軟骨環(huán)間隙緩慢注入BLMA5(5mg/kg體重)，正常對照組在相同條件下注入等體積生理鹽水。注藥后立即將小鼠直立，沿身體縱軸左右旋轉(zhuǎn)3-5min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)，然后縫合皮膚、消毒，待小鼠清醒后送清潔級觀察室常規(guī)飼養(yǎng)。整個手術(shù)過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則。術(shù)前l(fā)日及術(shù)后3天所有小鼠連續(xù)肌肉注射80萬單位青霉素鈉(0.1ml/只/天)。給藥方案各組動物經(jīng)博萊霉素造模后，第二天開始按照相應(yīng)的體重灌服給藥，正常對照組及模型組給予相應(yīng)體積5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，各治療組分別給予不同劑量的黃芩素提取物及陽性對照藥潑尼松。每隔一天小鼠稱重一次，連續(xù)給藥28天。羥脯氨酸(HYP)的測定動物處死當(dāng)日，取右肺中葉約30克置于有刻度的10ml玻璃試管中，_201:冰箱保存，以備測定各實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織中羥脯氨酸的含量；具體測定方法如下將0.5ml水解液準(zhǔn)確加入冷凍保存小塊肺組織的刻度玻璃試管內(nèi)，混勻，加蓋后沸水浴水解20分鐘，其中io分鐘混勻一次。之后將試管內(nèi)液體ra值調(diào)至6.5左右，加適量活性炭，混勻，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，3500r/min離心10min，取上清0.5ml，依次加入三種反應(yīng)試劑，混勻，6(TC水浴15min，冷卻后3500r/min離心10min，取上清液于紫外可見分光光度計(jì)上(型號T6新世紀(jì))550nm，lcm光徑下測定各管的吸光度，按說明書公式計(jì)算肺組織中HYP含量。5.4統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以S士s表示，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)比較組間差異性，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.5試驗(yàn)結(jié)果模型組小鼠肺組織與正常組小鼠相比，肺組織羥脯氨酸(HYP)含量明顯增加(P<0.01)。與模型組小鼠相比，黃芩素提取物各劑量組及醋酸潑尼松組小鼠肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量明顯減少(P<0.01)，見表5。表5黃吝素提取物提取物對BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠肺組織HYP含量的影響(x±sn=15)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>##P<0.Olvscontrol;*P<0.05，**P<0.Olvsmodel.5.6結(jié)論模型組小鼠肺組織內(nèi)間接反映肺組織細(xì)胞間質(zhì)膠原生成的羥脯氨酸含量顯著增加。給予黃芩素提取物可明顯減少肺纖維化小鼠肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量。陽性藥醋酸潑尼松亦可明顯減少纖維化小鼠肺組織內(nèi)羥脯氨酸的含量。提示黃芩素提取物抗纖維化作用可能與其減少肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量從而抑制肺組織內(nèi)膠原的生成有關(guān)。實(shí)施例66.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察黃芩素提取物對BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織肺泡炎及肺纖維化程度的影響6.2實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動物昆明種小鼠，90只，雌雄兼有，體重18-22克，清潔級，由蘇州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2007-0007，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK(蘇)2007-0035。試驗(yàn)期間飼養(yǎng)室溫度20±3.2°C，相對濕度為55±10%。試驗(yàn)藥物黃芩素提取物，黃芩素含量為^50%，棕黃色結(jié)晶，批號090429，由本所植化室從黃芩根中提取而得，4t:冰箱保存。臨用加5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)制成混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配；博萊霉素A5(BLMA5)，白色凍干粉末，15mg/支，日本化藥株式會社生產(chǎn)，批號880990，進(jìn)口藥品注冊證號H20040205;注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H13020657;4%水合氯醛；醋酸潑尼松片，5mg/片，江蘇徐州平光制藥有限責(zé)任公司，批號32022681。實(shí)驗(yàn)儀器光學(xué)顯微鏡，OLYMPUSCX31，由日本奧林巴斯公司生產(chǎn)。6.3試驗(yàn)方法動物分組昆明種小鼠，90只，雌雄兼有，體重18-22克，按性別體重隨機(jī)分為6組，即正常對照組、模型組、黃吝素提取物大(200mg/kg/d)、中(100mg/kg/d)及小劑量組(50mg/kg/d)和陽性對照藥醋酸潑尼松組(6.67mg/kg/d)，每組小鼠15只。模型制備模型組與各治療組小鼠采用BLM復(fù)制動物肺纖維化模型。具體操作步驟如下實(shí)驗(yàn)時，小鼠用4%的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰臥手術(shù)臺，固定頭部及四肢，常規(guī)消毒，無菌條件下行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，lml注射器剌入模型組、黃芩素提取物各治療組及醋酸潑尼松組小鼠氣管軟骨環(huán)間隙緩慢注入BLMA5(5mg/kg體重)，正常對照組在相同條件下注入等體積生理鹽水。注藥后立即將小鼠直立，沿身體縱軸左右旋轉(zhuǎn)3-5min，使藥液均勻分布于兩側(cè)肺內(nèi)，然后縫合皮膚、消毒，待小鼠清醒后送清潔級觀察室常規(guī)飼養(yǎng)。整個手術(shù)過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則。術(shù)前l(fā)日及術(shù)后3天所有小鼠連續(xù)肌肉注射80萬單位青霉素鈉(0.lml/只/天)。給藥方案各組動物經(jīng)博萊霉素造模后，第二天開始按照相應(yīng)的體重灌服給藥，正常對照組及模型組給予相應(yīng)體積5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，各治療組分別給予不同劑量的黃芩素提取物及陽性對照藥潑尼松。每隔一天小鼠稱重一次，連續(xù)給藥28天。肺組織病理切片染色右下肺組織在4%中性福爾馬林溶液中固定，經(jīng)逐級酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)切片4iim，后行HE染色。根據(jù)Sz即iel等方法確定肺泡炎和肺纖維化的程度。進(jìn)行HE染色的病理切片根據(jù)肺泡炎程度分為4級。0分無明顯病理改變，無肺泡炎或極少數(shù)炎性細(xì)胞浸潤(_);l分輕度病理改變，較少炎性細(xì)胞浸潤，輕度肺泡炎改變(+);病變范圍局限在全肺的20%以下；2分中度病理改變，少量炎性細(xì)胞浸潤致中度肺泡炎(++)，病變范圍占全肺的20%-50%;3分重度病理改變，大量炎性細(xì)胞浸潤，重度肺泡炎改變(+++)，病變范圍大于50%。肺間質(zhì)纖維化程度亦分為4級，0分無明顯病理改變，無肺間質(zhì)纖維化(_);l分輕度病理改變，肺泡間隔因細(xì)胞浸潤增寬，成纖維細(xì)胞輕度增生，輕度肺間質(zhì)纖維化(+)，病變范圍局限在全肺20%以下；2分中度病理改變，中度成纖維細(xì)胞增生聚集，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，中度肺間質(zhì)纖維化(++)，病變范圍占全肺的20%-50%;3分重度病理改變，大量成纖維細(xì)胞增生聚集，肺泡融合，肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，發(fā)生重度肺間質(zhì)纖維化，病變范圍大于50%。6.4統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以^士s表示，等級計(jì)數(shù)資料轉(zhuǎn)化為計(jì)量資料后進(jìn)行t檢驗(yàn)，比較組間差異性，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.5試驗(yàn)結(jié)果小鼠肺組織經(jīng)石蠟切片并行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其病理組織學(xué)變化顯示正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔透亮，肺泡壁完整，肺泡間隔未見增厚及炎細(xì)胞浸潤。模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔變窄或消失，肺泡間隔顯著增厚，肺間質(zhì)大量成纖維細(xì)胞增生和膠原纖維沉積，大量炎細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)纖維化形成。黃芩素提取物各劑量組小鼠與模型組相比，肺泡結(jié)構(gòu)、肺泡腔、肺泡間隔、膠原纖維沉積、成纖維細(xì)胞增生等病理改變均有不同程度改善，肺組織的肺泡炎程度減輕或明顯減輕(P<0.05，P<0.01)，肺纖維化病變程度減輕或明顯減輕(P<0.05，P<0.01)。醋酸潑尼松組小鼠肺組織的肺泡炎及肺纖維化病變程度均減輕(P<0.05)，見表6、圖1。表6黃吝素提取物對BLM誘導(dǎo)肺纖維化小鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響(;c±sn=15)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>##P<0.Olvscontrol;承P<0.05，承承P<0.Olvsmodel.6.6結(jié)論BLM造模28天后，模型組小鼠肺泡炎和間質(zhì)肺纖維化程度明顯，呈現(xiàn)典型的肺纖維化病理改變。給藥28天后，黃芩素提取物可減輕或明顯減輕小鼠肺泡炎程度，并可不同程度地減輕肺纖維化程度。陽性藥醋酸潑尼松亦可減輕小鼠肺組織的肺泡炎和纖維化程度，提示黃芩素提取物具有一定的抗肺泡炎癥作用和抗肺纖維化形成的作用。綜上所述，黃芩素提取物對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化具有一定的防治作用，該作用機(jī)制與其改善機(jī)體機(jī)能狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力、抗炎癥反應(yīng)、抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、抑制羥自由基產(chǎn)生、加強(qiáng)氧自由基清除、抑制肺組織內(nèi)膠原生成及成纖維細(xì)胞增殖有關(guān)。權(quán)利要求一種黃芩素提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用。2.權(quán)利要求1所述的黃芩素提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物黃芩素提取物其中黃芩素的含量為^50%。3.權(quán)利要求1所述的黃芩素提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物為含有治療有效量的黃芩素提取物可與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合制備藥物。全文摘要本發(fā)明公開了黃芩素提取物在制備防治肺纖維化藥物中的應(yīng)用，通過氣管內(nèi)滴注博萊霉素(Bleomycin，BLM)復(fù)制小鼠肺纖維化動物模型，首次選用黃芩素提取物作為治療藥物，研究黃芩素提取物對肺纖維化動物肺組織及血清相關(guān)生化指標(biāo)及病理學(xué)改變的影響，觀察黃芩素提取物對肺纖維化動物模型的治療作用，從而為黃芩素提取物治療肺纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。所述的藥物為含有治療有效量的黃芩素提取物可與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合制備藥物。文檔編號A61K36/185GK101716171SQ200910186439公開日2010年6月2日申請日期2009年11月2日優(yōu)先權(quán)日2009年11月2日發(fā)明者周忠繼,蔣小崗,郭次儀,顧振綸,高燕申請人:蘇州中藥研究所