本發(fā)明涉及生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及一種高產(chǎn)飼用復(fù)合酶米曲霉菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豆粕、棉籽粕、谷朊粉、羽毛粉等農(nóng)副產(chǎn)品中粗蛋白含量高，價(jià)格低廉，但蛋白分子量較大，不易被消化利用，氨基酸組成不平衡，有效利用率較低，其飼料添加量與利用率較低。同時(shí)，還存在多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制因子、脲酶等，研究發(fā)現(xiàn)，這些抗?fàn)I養(yǎng)因子影響了畜禽對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的消化、吸收，影響動(dòng)物的健康及生產(chǎn)性能。而農(nóng)副產(chǎn)品發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生蛋白酶、非淀粉多糖酶等多種酶活，可消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，把大分子量的餅粕蛋白質(zhì)分解為多肽、寡肽，甚至小肽，從而增加水溶性，利于動(dòng)物消化吸收。
米曲霉(aspergillusoryzae)是一種好氣性真菌，易于培養(yǎng)，又不產(chǎn)生黃曲霉素，是一類(lèi)有較高利用價(jià)值的霉菌。米曲霉是美國(guó)食品與藥品管理局fda認(rèn)可的使用安全的菌種之一，其在在食品業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、生物技術(shù)等方面都得到了廣泛的應(yīng)用。米曲霉是一類(lèi)產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀木聚糖酶、纖維素酶、植酸酶等。在蛋白酶的作用下，將不易消化的大分子蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、多肽及各種氨基酸，而且可以使輔料中粗蛋白、粗纖維、植酸等難吸收的物質(zhì)降解，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、保健功效和消化率。
目前，多肽的生產(chǎn)方法有酶解法和微生物發(fā)酵法。酶解法生產(chǎn)多肽較為簡(jiǎn)單，易于操作，且生產(chǎn)效率較高，但所用酶制劑較多且昂貴，生產(chǎn)成本很高；微生物發(fā)酵法主要是利用微生物對(duì)蛋白物料進(jìn)行發(fā)酵處理，既可以將有毒的成分經(jīng)微生物代謝去除，又可以通過(guò)微生物發(fā)酵將植物細(xì)胞壁徹底破壞，使得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更易釋放，有利于動(dòng)物更快更好的吸收，而且發(fā)酵對(duì)飼料的營(yíng)養(yǎng)成分破壞很小，不會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低，且成本較低、并可大量操作。但是，生產(chǎn)多肽需先利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生蛋白酶，再用蛋白酶將難以被動(dòng)物消化吸收的大分子蛋白部分降解，產(chǎn)生多種小分子活性多肽，其步驟較為復(fù)雜，生產(chǎn)效率偏低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
1.要解決的技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種高產(chǎn)飼用復(fù)合酶的米曲霉菌株及利用其以液態(tài)發(fā)酵和酶解復(fù)合技術(shù)制備富多肽飼料添加劑的方法，其以富蛋白農(nóng)副產(chǎn)物為材料，以米曲霉為菌種進(jìn)行發(fā)酵，高效生成后續(xù)酶解所需的蛋白酶、菊粉酶等多種酶制劑，用產(chǎn)生的液態(tài)混合酶制劑制備富多肽飼料添加劑。該發(fā)明充分利用了微生物發(fā)酵和酶解技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，大大減少了酶制劑的分離純化的生產(chǎn)成本，發(fā)酵結(jié)束后直接用發(fā)酵液處理富蛋白農(nóng)副產(chǎn)物用，降低了多肽的生產(chǎn)成本，加快了多肽的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程；且制得的飼料添加劑具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗病性能，具有廣闊的應(yīng)用前景。
2.技術(shù)方案
本發(fā)明的目的是提供一種用于發(fā)酵產(chǎn)酶用于制備多肽飼料的米曲霉菌株及利用該菌株發(fā)酵制得的酶來(lái)酶解蛋白制備富多肽飼料添加劑的方法。
由背景技術(shù)中可知，要制備多肽飼料，蛋白酶必不可少。另外，菊粉作為一種純天然的功能性配料，已被世界20多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)為營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，廣泛運(yùn)用于乳制品、飲料、低脂低熱量食品、烘培食品、保健食品。利用菊粉酶分解菊粉生產(chǎn)的低聚果糖低聚果糖是一種良好的雙歧因子和水溶性膳食纖維，有防治便秘、抑制腸內(nèi)腐敗物質(zhì)形成、提高機(jī)體免疫力、改善脂質(zhì)代謝、降低膽固醇等作用。故而，本發(fā)明所要提供的米曲霉菌株要求能高產(chǎn)蛋白酶和菊粉酶。
本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：
本發(fā)明所提供的高產(chǎn)飼用蛋白酶和菊粉酶的米曲霉菌株具體為米曲霉(aspergillusoryzae)dj36，是從江蘇徐州市屠宰場(chǎng)、肉類(lèi)銷(xiāo)售市場(chǎng)、豆制品廠(chǎng)附近土樣分離得到。具體制備過(guò)程如下：
(1)富集培養(yǎng)：吸取2-4ml處理后的土樣渾濁液，加入到裝有30-60ml富集培養(yǎng)基一的容量為250ml的三角瓶中，置于35-40℃、轉(zhuǎn)速180-200r/min條件下的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)5-7d；然后在無(wú)菌操作下量取30-50ml富集培養(yǎng)液至離心管中，在轉(zhuǎn)速4000-5000r/min下離心5-10min，以富集培養(yǎng)基二將離心后的沉淀洗至裝有40-50ml富集培養(yǎng)基二的250ml三角瓶中，置于35-40℃、轉(zhuǎn)速160-200r/min條件下的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3-4d；
(2)菌株初篩：將富集后的培養(yǎng)液逐級(jí)稀釋到10-3、10-4、10-5、10-6，取各級(jí)稀釋的培養(yǎng)液0.2ml分別涂布于霉菌篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿晾至表面沒(méi)有流動(dòng)液體時(shí)，用保鮮膜將培養(yǎng)皿口封好，并置于35-40℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2-3d，然后將平板置于25-28℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)倒置培養(yǎng)1-2d；將平板上長(zhǎng)出的菌落點(diǎn)種到兩個(gè)初篩選擇培養(yǎng)基的相同位置，兩個(gè)初篩培養(yǎng)基分別為蛋白酶初篩培養(yǎng)基和菊粉酶初篩培養(yǎng)基；接種好的培養(yǎng)皿置于35-40℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2-4d；待有明顯菌落形成，觀(guān)察蛋白酶初篩培養(yǎng)基上有無(wú)明顯透明圈出現(xiàn)；將菊粉酶初篩平板上加入一定量0.1％的剛果紅染液，染色2-8min；觀(guān)察菌落周?chē)鷦偣t顏色是否明顯變淺；將在兩種初篩平板上均出現(xiàn)明顯相應(yīng)變化的菌株從蛋白酶初篩平板上接種出來(lái)，待進(jìn)行復(fù)篩；
(3)菌株復(fù)篩：將初篩得到的菌株于復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)，置于30-37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d，重復(fù)劃線(xiàn)培養(yǎng)，如連續(xù)多次觀(guān)察到菌落形態(tài)一致則認(rèn)為菌株已純化；將純化后的菌株接種到固體種子培養(yǎng)基上，選取活性較高的菌株進(jìn)行劃線(xiàn)傳代培養(yǎng)，最終得到一株產(chǎn)酶穩(wěn)定的菌株，即得高產(chǎn)飼用復(fù)合酶的米曲霉。
上述高產(chǎn)飼用酶復(fù)合酶(蛋白酶和菊粉)的米曲霉具有以下微生物學(xué)特征：
(1)形態(tài)學(xué)特征
本發(fā)明所述菌株，菌落在pda平板上呈輻射狀快速生長(zhǎng)，菌絲發(fā)達(dá)，初期菌絲表面疏松、平坦，菌落正面白色，接著因產(chǎn)生分生孢子菌落中間部位而呈現(xiàn)黃綠色，以后逐漸增多，呈褐色或淡綠褐色，菌落背面有褶皺，無(wú)色。菌落無(wú)滲出液，無(wú)特殊氣味。在放大400倍的光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，菌絲發(fā)達(dá)，有隔膜，菌絲頂端直接產(chǎn)生孢子梗，分生孢子成鏈狀生于小梗上，分生孢子頭呈球形。
(2)分子鑒定
以菌株基因組為模板，pcr擴(kuò)增到18srdna特異性片段，經(jīng)過(guò)測(cè)序，所得序列通過(guò)blast與genebank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比對(duì)，鑒定為米曲霉(aspergillusoryzae)。
上述菌株已于2017年2月10日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101)，保藏號(hào)為cgmccno.13575，分類(lèi)命名為米曲霉dj36(aspergillusoryzaedj36)。
本發(fā)明還提供了一種上述高產(chǎn)飼用復(fù)合酶的米曲霉菌株應(yīng)用于以液態(tài)發(fā)酵和酶解復(fù)合技術(shù)制備富多肽飼料添加劑的方法，包括如下步驟：
步驟1、制備米曲霉菌的單孢子菌懸液：
將米曲霉菌菌種活化后，用含有0.01％v/v吐溫80的0.75％無(wú)菌生理鹽水將孢子洗下，放到裝有50ml無(wú)菌生理鹽水和無(wú)菌玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩20-30min，待孢子充分打散后，調(diào)節(jié)孢子懸液中孢子的含量為1.0×108cfu/ml，即得單孢子菌懸液；
步驟2、液體菌種制備：
按照5％-10％v/v的接種量，將步驟1中所得的單孢子菌懸液接種在裝有30-50ml已滅菌的種子培養(yǎng)基的250ml三角燒瓶中，培養(yǎng)基中加入20粒已滅菌的玻璃珠，瓶口以6-8層紗布封口，置于空氣搖床中擴(kuò)大培養(yǎng)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為180-220r/min，溫度為26-34℃，培養(yǎng)2-4d，得到二級(jí)種子培養(yǎng)液；
步驟3、液態(tài)發(fā)酵：
在發(fā)酵容器中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌20-30min，將溫度逐漸降至28-32℃，取步驟2所得的二級(jí)種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵容器中，初始發(fā)酵控制條件為：溫度28-32℃，發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph5.5-6.5；發(fā)酵2-4d，發(fā)酵溫度降為25-28℃；發(fā)酵至3d開(kāi)始補(bǔ)料每隔12h補(bǔ)料一次，共補(bǔ)料2-3次；發(fā)酵6d時(shí)，將發(fā)酵溫度提高至35-40℃，用2mol/l的naoh調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph值；發(fā)酵6d時(shí)，添加滅過(guò)菌的豆粕粉和谷朊粉懸浮液；繼續(xù)發(fā)酵至7d，接著將溫度提高到45-50℃，并將發(fā)酵液ph調(diào)節(jié)至7.0-7.5，維持4h，結(jié)束發(fā)酵；
步驟4、發(fā)酵液酶解雜蛋白：
發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液導(dǎo)入酶解罐中，向發(fā)酵液中添加麩皮、谷糠、豆粕粉、谷朊粉，使發(fā)酵液變成濃稠狀，調(diào)節(jié)其ph值為5.5，控制溫度為50℃，維持4-6h，中間攪拌2-3次；調(diào)節(jié)ph到4.0-7.0，控制溫度為50℃，維持4-6h，得到發(fā)酵酶解料；
步驟5、干燥、粉碎、包裝：
酶解結(jié)束后，采取55-65℃低溫烘干的方法對(duì)以上發(fā)酵酶解料進(jìn)行干燥處理，粉碎后過(guò)150-200目篩，成品包裝得到富多肽飼料添加劑。
進(jìn)一步地，所述步驟3中當(dāng)所需發(fā)酵的二級(jí)種子培養(yǎng)液較少時(shí)，所述發(fā)酵容器為三角瓶，具體步驟為：將裝有發(fā)酵培養(yǎng)基200-300ml的1000ml三角瓶置于121℃下滅菌20-30min，將溫度逐漸降至28-32℃，將步驟2所得的二級(jí)種子培養(yǎng)液按照5-10％的接種量接種，置于搖床上震蕩發(fā)酵；初始發(fā)酵溫度28-32℃，發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph5.5-6.5，搖床震蕩頻率180-200r/min；發(fā)酵2d-4d，發(fā)酵溫度降為25-28℃，搖床震蕩頻率不變；發(fā)酵至3d開(kāi)始補(bǔ)料，每次補(bǔ)料20-30ml，每隔12h補(bǔ)料一次，共補(bǔ)料2-3次；發(fā)酵6d時(shí)，將發(fā)酵溫度提高至35-40℃，用2mol/l的naoh調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph值為5.0-6.5，搖床轉(zhuǎn)速降至160-180r/min；發(fā)酵6d時(shí)，添加滅過(guò)菌的豆粕粉和谷朊粉懸浮液20-30ml；繼續(xù)發(fā)酵至7d，接著將溫度提高到45-50℃，并將發(fā)酵液ph調(diào)節(jié)至7.0-7.5，維持4h，結(jié)束發(fā)酵。
進(jìn)一步地，所述步驟3中當(dāng)所需發(fā)酵的二級(jí)種子培養(yǎng)液較多時(shí)，所述發(fā)酵容器為發(fā)酵罐，具體步驟為：在15l的發(fā)酵罐中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基8-10l，發(fā)酵罐夾套升溫至95℃，再將蒸汽直接通入發(fā)酵培養(yǎng)基中，121℃滅菌20-30min，將溫度逐漸降至28-32℃，取步驟2所得的二級(jí)種子培養(yǎng)液400-1000ml以火焰法接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐壓為0.05mpa；初始發(fā)酵控制條件為：溫度28-32℃，發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph5.5-6.5，無(wú)菌空氣通風(fēng)比1:0.6-0.8(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速260-300r/min，保持溶氧20-30％；發(fā)酵過(guò)程觀(guān)察泡沫情況，并流加以消泡劑泡敵，消除培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)多泡沫；發(fā)酵2-4d，發(fā)酵溫度降為25-28℃，無(wú)菌空氣通風(fēng)比1:0.4-0.6(v/v)，通過(guò)自動(dòng)流加氨水調(diào)節(jié)ph，控制ph于6.0-6.5；發(fā)酵至3d開(kāi)始補(bǔ)料，每次補(bǔ)料500-1000ml，每隔12h補(bǔ)料一次，共補(bǔ)料2-3次；發(fā)酵6d時(shí)，將發(fā)酵溫度提高至35-40℃，用2mol/l的naoh調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph值為6.0-7.0，降低無(wú)菌空氣通風(fēng)比1：0.4-0.6(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速降至200-240r/min；發(fā)酵6d時(shí)，添加滅過(guò)菌的豆粕粉和谷朊粉懸浮液1-2l；繼續(xù)發(fā)酵至7d，接著將溫度提高到45-50℃，并將發(fā)酵液ph調(diào)節(jié)至7.0-7.5，維持4h，結(jié)束發(fā)酵。
具體地，步驟2中所述種子培養(yǎng)基的制備方法為：分別取蛋白胨5-10g，黃豆粕粉5-10g，谷朊粉10-20g，麩皮粉5-10g，葡萄糖10-15g，淀粉10-20g，(nh4)2so41g，吐溫-800.5ml，無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液10ml，充分混合后，調(diào)節(jié)ph5.0-6.5，補(bǔ)充去離子水至1000ml，再置于121℃下滅菌15min。
具體地，步驟3中所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有菊粉；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為：分別取黃豆粕粉10-20g，谷朊粉10-20g，菊粉5-10g，麩皮粉5-10g，淀粉10-20g，(nh4)2so41g，吐溫-800.5ml，玉米漿15-30g，無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液10ml，充分混合后，補(bǔ)充去離子水至1000ml，再置于121℃下滅菌15min。
3.有益效果
(1)本發(fā)明采用米曲霉作為菌種，充分利用了微生物發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)，且米曲霉菌易于培養(yǎng)，使用安全，又不產(chǎn)生黃曲霉素。本發(fā)明具體采用高產(chǎn)伺用復(fù)合酶米曲霉，其制得的復(fù)合酶酶活力高，且復(fù)合酶中的蛋白酶具有較高的熱穩(wěn)定性和廣泛的耐酸范圍，在加工過(guò)程中不易失活，適合在飼料中使用；且米曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的復(fù)合酶中還含有菊粉酶，在其發(fā)酵培養(yǎng)基中添加菊粉，菊粉酶分解菊粉產(chǎn)生低聚果糖，添加在飼料中，有利于增強(qiáng)飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗病性能。
(2)本發(fā)明采用米曲霉菌和富蛋白農(nóng)副產(chǎn)品共同發(fā)酵產(chǎn)生大量蛋白酶、菊粉酶等多種酶活，為后期酶解過(guò)程提供主要作用酶，實(shí)現(xiàn)兩種技術(shù)的有效關(guān)聯(lián)。
(3)本發(fā)明結(jié)合液態(tài)發(fā)酵技術(shù)和酶解技術(shù)，先采用液態(tài)發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵米曲霉菌種和農(nóng)副產(chǎn)品，產(chǎn)生大量蛋白酶、菊粉酶等多種酶活；再采用酶解技術(shù)，利用上述多種酶活將富含粗蛋白的農(nóng)副產(chǎn)品分解，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子，把大分子量的餅粕蛋白質(zhì)分解為多肽、寡肽，甚至小肽，從而增加水溶性，利于動(dòng)物消化吸收?？梢怨?jié)約大量的酶制劑，降低多肽的生產(chǎn)成本，加快多肽的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。
本發(fā)明以富蛋白農(nóng)副產(chǎn)物為材料，米曲霉為菌種進(jìn)行發(fā)酵，高效生成后續(xù)酶解所需的蛋白酶、菊粉酶等多種酶制劑，用產(chǎn)生的液態(tài)混合酶制劑制備富多肽飼料添加劑。充分利用了微生物發(fā)酵和酶解技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，大大減少了酶制劑的使用，減少了酶制劑的分離純化的生產(chǎn)成本，降低了多肽的生產(chǎn)成本，加快了多肽的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程；且制得的飼料添加劑具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗病性能，具有廣闊的應(yīng)用前景。
附圖說(shuō)明
圖1為實(shí)施例中復(fù)篩后得到的純化的米曲霉菌株；
圖2為實(shí)施例1中米曲霉所產(chǎn)蛋白酶在不同溫度下的活性測(cè)定折線(xiàn)圖；
圖3為實(shí)施例1中米曲霉蛋白酶于50℃在不同ph條件下的活性測(cè)定折線(xiàn)圖；
圖4為實(shí)施例1中米曲霉蛋白酶于酸性(ph5.0)的條件下在不同溫度下的熱穩(wěn)定性測(cè)定折線(xiàn)圖；
圖5為實(shí)施例1中米曲霉蛋白酶在于30℃在不同ph條件下的ph穩(wěn)定性測(cè)定折線(xiàn)圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
實(shí)施例1
1.高產(chǎn)伺用復(fù)合酶蛋白酶與菊粉酶菌株的制備
(1)采樣及樣品處理：
從江蘇省徐州市屠宰場(chǎng)、肉類(lèi)銷(xiāo)售市場(chǎng)、豆制品加工廠(chǎng)、菊芋種植地等富含蛋白質(zhì)及菊芋的地方取土樣20份。稱(chēng)取固體土樣5g，放入裝有玻璃珠及100ml已滅菌的生理鹽水的三角瓶中，以180r/min的轉(zhuǎn)速室溫振蕩20-30min，制成懸液備用。
(2)富集培養(yǎng)：
吸取2-4ml處理后的土樣渾濁液，加入至裝有30-60ml富集培養(yǎng)基一的容量為250ml的三角瓶中，置于35-40℃、轉(zhuǎn)速180-200r/min下恒溫?fù)u床中培養(yǎng)5-7d；然后無(wú)菌操作下量取30-50ml富集培養(yǎng)液至離心管中，4000-5000r/min離心5-10min，倒掉上清液，以富集培養(yǎng)基二將離心后的沉淀洗至裝有40-50ml富集培養(yǎng)基二的250ml三角瓶中，再次置于35-40℃、轉(zhuǎn)速160-200r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3-4d。
上述富集培養(yǎng)基一的制備方法為：分別取豆粕粉1g、谷朊粉0.5g，無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液1ml，混合均勻后補(bǔ)充水至100ml，調(diào)節(jié)ph值為4.5；在121℃溫度下滅菌15min，自然冷卻后，加入過(guò)濾除菌的氨芐青霉素至溶液最終濃度為50mg/l。
上述富集培養(yǎng)基二的制備方法為：分別取菊芋粉2g、無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液1ml，混合均勻后補(bǔ)充水至100ml，調(diào)節(jié)ph值為4.5；在121℃溫度下滅菌15min，自然冷卻后，加入過(guò)濾除菌的氨芐青霉素至溶液最終濃度為50mg/l。
上述制備方法中無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液的制備方法為：分別取(nh4)2so45g，nano32.0g，尿素2g，k2hpo41.5g，cacl21.5g，mgso40.1g，feso4·7h2o0.01g，mns04·h201.6mg，zns04·h2o0.05g，cocl20.5mg，去離子水1000ml，混合均勻。
(3)初篩：
將富集后的培養(yǎng)液逐級(jí)稀釋到10-3、10-4、10-5、10-6，取各級(jí)稀釋的培養(yǎng)液0.2ml分別涂布于霉菌篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿晾至表面沒(méi)有流動(dòng)液體時(shí)，用保鮮膜將培養(yǎng)皿口封好，并置于35-40℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2-3d，然后將平板置于25-28℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)倒置培養(yǎng)1-2d。
將平板上長(zhǎng)出的菌落點(diǎn)種到兩個(gè)初篩選擇培養(yǎng)基的相同位置，兩個(gè)初篩培養(yǎng)基分別為蛋白酶初篩培養(yǎng)基和菊粉酶初篩培養(yǎng)基。接種好的培養(yǎng)皿置于35-40℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2-4d。待有明顯菌落形成，觀(guān)察蛋白酶初篩培養(yǎng)基上有無(wú)明顯透明圈出現(xiàn)。將菊粉酶初篩平板上加入一定量0.1％的剛果紅染液，染色2-8min，倒掉染色液。觀(guān)察菌落周?chē)鷦偣t顏色是否明顯變淺。將在兩種初篩平板上均出現(xiàn)水解圈的菌株從蛋白酶初篩平板上接種出來(lái)，待進(jìn)行復(fù)篩。
上述霉菌篩選培養(yǎng)基的制備方法為：分別取pda培養(yǎng)基800ml，無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液10ml，混合均勻后，補(bǔ)水至1000ml，再加入瓊脂粉15g并充分混合；在121℃溫度下滅菌15min后加入孟加拉紅0.01-0.02g，氯霉素0.1-0.2g，混合均勻。
所述pda培養(yǎng)基包括馬鈴薯浸出液和蔗糖，具體的制備方法為：稱(chēng)取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000ml煮沸半個(gè)小時(shí)，再用紗布過(guò)濾取濾液，補(bǔ)充水至1000ml，然后加入20g蔗糖并混合均勻。
上述蛋白酶初篩培養(yǎng)基的制備方法為：分別取pda培養(yǎng)基100ml，干酪素1-2g，無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液1ml，瓊脂粉1.5g，混合均勻后，調(diào)節(jié)ph值為5.0-5.5；培養(yǎng)基在121℃溫度下滅菌20min后，充分搖勻，隨著搖動(dòng)，在60-70℃下倒入平板中。
上述菊粉酶初篩培養(yǎng)基的制備方法為：分別取菊粉1-2g，酵母粉0.1-0.2g，無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液1ml，瓊脂1.5g，混合均勻后，加蒸餾水定容至100ml，調(diào)節(jié)ph值為4.5；在121℃溫度下滅菌15min。
(3)復(fù)篩
初篩得到的菌株于復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)，置于30-37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d，重復(fù)劃線(xiàn)培養(yǎng)三次以上，如連續(xù)多次觀(guān)察到菌落形態(tài)一致則認(rèn)為菌株已純化。本發(fā)明所述菌株如圖1所示，編號(hào)為dj36。
將初篩得到的菌株純化后，接種到固體種子培養(yǎng)基上，35-40℃下培養(yǎng)3-5d，切取1平方厘米的菌苔接種到裝有30-50ml液體種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在160-180r/min轉(zhuǎn)速下37-40℃進(jìn)行液體震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)3-4d后，按照6-10％(v/v)的接種量，將液體種子接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)中，在160-180r/min轉(zhuǎn)速下30-37℃進(jìn)行液體震蕩發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)3-5d，將發(fā)酵液在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min后，收集上清液并測(cè)定蛋白酶活性和菊粉酶活性，結(jié)果如表1所示。選取活性較高的菌株(dj36)進(jìn)行劃線(xiàn)傳代培養(yǎng)，最終得到一株產(chǎn)酶穩(wěn)定且有較高酶活的蛋白酶、菊粉酶高產(chǎn)菌株。純化的菌株接種于pda斜面培養(yǎng)基上，在4℃條件下保藏。
上述復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為：分別取菊粉2-3g，無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液1ml，蛋白胨1g，大豆蛋白1-2g，麩皮粉2-3g，吐溫-800.5ml，無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液1ml，混合均勻后，補(bǔ)充去離子水至100ml；在121℃溫度下滅菌15min。
上述固體種子培養(yǎng)基的制備方法為：分別取pda培養(yǎng)基99ml，無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液1ml，瓊脂粉1.5g，混合均勻后，調(diào)節(jié)ph值為5.0；在121℃溫度下滅菌15min。
上述液體種子培養(yǎng)基的制備方法為：分別取菊粉2-3g，大豆蛋白1g，蛋白胨1g，無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液1ml，混合均勻后，補(bǔ)充去離子水至100ml；在121℃溫度下滅菌15min。
上述菊粉酶活力的測(cè)定步驟為：發(fā)酵結(jié)束后，過(guò)濾，得到的濾液在8000r/min的轉(zhuǎn)速下離心20min；收集濾液作為粗酶液，取適當(dāng)稀釋的粗酶液0.2ml與0.8ml2％菊糖(用0.1mol/l，ph4.5醋酸緩沖液配制)在60℃條件下反應(yīng)20min后，于100℃加熱5min終止酶反應(yīng)，然后取1ml的反應(yīng)液用dns顯色法測(cè)定產(chǎn)物中還原糖的量。在相同的條件下，用100℃滅活的粗酶液作為對(duì)照。菊粉酶酶活力定義為：在ph4.5，60℃的環(huán)境中反應(yīng)20min，每分鐘轉(zhuǎn)化成1μmol還原糖的酶量為一個(gè)酶活單位。
上述發(fā)酵液中蛋白酶活的測(cè)定步驟為：采用folin-酚法測(cè)定，以酪蛋白(2％)為底物，1ml酶液在ph5.0、40℃下，一個(gè)蛋白酶活力單位(u)定義為每分鐘釋放出1μg酪氨酸所需的酶量。
表1各菌株粗酶液酶活
2.菌株的鑒定
上述高產(chǎn)飼用復(fù)合酶(蛋白酶和菊粉酶)的米曲霉dj36具有以下微生物學(xué)特征：
(1)形態(tài)學(xué)特征
本發(fā)明所述菌株dj36，菌落在pda平板上呈輻射狀快速生長(zhǎng)，菌絲發(fā)達(dá)，初期菌絲表面疏松、平坦，菌落正面白色，接著因產(chǎn)生分生孢子菌落中間部位而呈現(xiàn)黃綠色，以后逐漸增多，呈褐色或淡綠褐色，菌落背面有褶皺，無(wú)色。菌落無(wú)滲出液，無(wú)特殊氣味。在放大400倍的光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，菌絲發(fā)達(dá)，有隔膜，菌絲頂端直接產(chǎn)生孢子梗，分生孢子成鏈狀生于小梗上，分生孢子頭呈球形。
(2)分子鑒定
以上形態(tài)特征與《真菌鑒定手冊(cè)》中米曲霉的形態(tài)特征相符合；根據(jù)其分子生物學(xué)特征，以菌株dj36基因組為模板，pcr擴(kuò)增到18srdna特異性片段，經(jīng)過(guò)測(cè)序，所得序列通過(guò)blast與genebank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比對(duì)，鑒定為米曲霉(aspergillusoryzae)。米曲霉具有豐富的蛋白酶系，是美國(guó)食品與藥物管理局和美國(guó)飼料公司協(xié)會(huì)公布的安全微生物菌株之一，也是國(guó)內(nèi)醬油等發(fā)酵食品生產(chǎn)的主要菌株。因此，米曲霉用于發(fā)酵制備富多肽蛋白飼料是非常安全的。
3.米曲霉產(chǎn)酶中蛋白酶的特性研究
(1)米曲霉蛋白酶的最適作用溫度
最適溫度的測(cè)定：在0.02mol/l，ph4.5的醋酸緩沖液中，不同溫度(30-65℃)下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶在不同溫度下的測(cè)定結(jié)果如圖2所示。在溫度30-50℃之間，酶活性隨溫度上升大幅增加，但當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，酶活性逐漸降低。故酶最適作用溫度為50℃。在較高的溫度下酶保持高活性，在蛋白酶的應(yīng)用中具有重要意義；溫度高可以加快酶促反應(yīng)；另一方面，較高的溫度可以有效防止腐敗微生物大量繁殖，有效防止腐敗變質(zhì)。
(2)米曲霉蛋白酶最適作用ph
配制一系列ph范圍為3.0-11.0的緩沖溶液，將米曲霉蛋白酶適當(dāng)稀釋后，于50℃下測(cè)定其在不同ph條件下的活性，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，米曲霉蛋白酶系在ph4.0-7.0廣泛范圍內(nèi)都具有較高的活力，該范圍內(nèi)酶活力均在90％以上；因此該酶適合在飼料中應(yīng)用。
(3)溫度對(duì)米曲霉蛋白酶活性的影響
分別在30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃下測(cè)定米曲霉蛋白酶在酸性(ph5.0)的熱穩(wěn)定性。結(jié)果圖4所示，蛋白酶在60℃以下比較穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)60min的孵育后，殘余酶活性都在80％以上。故該蛋白酶屬于耐熱性酶，在加工過(guò)程中，高溫環(huán)境下不易失活，適合在飼料中使用。
(4)酸堿性對(duì)米曲霉蛋白酶活性的影響
米曲霉蛋白酶ph穩(wěn)定性測(cè)定是將酶液加入到20ml的不同ph值緩沖液中，于30℃下保溫1h，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活性。所用緩沖液：ph6.0-7.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，ph8.0-8.5的tris-hcl緩沖液，ph9.0-10.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，ph11.0-12.0的磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液。結(jié)果如圖5所示，從圖看出蛋白酶在有廣泛的酸性范圍內(nèi)都保持高活性，在ph2.0-8.0之間，酶活保持在80％以上。
實(shí)施例2
用三角瓶發(fā)酵制備富多肽飼料添加劑(適用于所需發(fā)酵的二級(jí)種子培養(yǎng)液較少的情況)，包括如下步驟：
步驟1、菌種活化
從保存的米曲霉dj36菌種斜面上刮取1環(huán)米曲霉孢子，接種于菌種的活化固體種子培養(yǎng)基上，在28-32℃的生化培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)3-5d，讓菌種活化，孢子充分成熟后，結(jié)束培養(yǎng)。
步驟2、制備米曲霉菌的單孢子菌懸液
用含有0.01％v/v吐溫80的0.75％無(wú)菌生理鹽水將步驟1培養(yǎng)好的孢子洗下，放到裝有50ml無(wú)菌生理鹽水和無(wú)菌玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩20-30min。待孢子充分打散后，制備孢子含量為1.0×108cfu/ml的孢子懸液，即得單孢子菌懸液。
步驟3、液體菌種制備
按照5％-10％v/v的接種量，將上述單孢子菌懸液接種在裝有30-50ml已滅菌的種子培養(yǎng)基的250ml三角燒瓶中，培養(yǎng)基中加20粒滅菌的玻璃珠，以6-8層紗布封口，置于空氣搖床中擴(kuò)大培養(yǎng)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為180-220r/min，于26-34℃下培養(yǎng)2-4d。
上述種子培養(yǎng)基的制備方法為：分別取蛋白胨5-10g，黃豆粕粉5-10g，谷朊粉10-20g，麩皮粉5-10g，葡萄糖10-15g，淀粉10-20g，(nh4)2so41g，吐溫-800.5ml，無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液10ml，混合均勻后，調(diào)節(jié)ph至5.0-6.5，補(bǔ)充去離子水至1000ml；在121℃溫度下滅菌15min。
步驟4、液態(tài)發(fā)酵制備復(fù)合酶
將裝有發(fā)酵培養(yǎng)基200-300ml的1000ml三角瓶置于121℃下滅菌20-30min，將溫度逐漸降至28-32℃，將步驟2所得的二級(jí)種子培養(yǎng)液按照5-10％的接種量接種，置于搖床上震蕩發(fā)酵；初始發(fā)酵溫度28-32℃，發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph5.5-6.5，搖床震蕩頻率180-200r/min；發(fā)酵2d-4d，發(fā)酵溫度降為25-28℃，搖床震蕩頻率不變；發(fā)酵至3d開(kāi)始補(bǔ)料，每次補(bǔ)料20-30ml，每隔12h補(bǔ)料一次，共補(bǔ)料2-3次；發(fā)酵6d時(shí)，將發(fā)酵溫度提高至35-40℃，用2mol/l的naoh調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph值為5.0-6.5，搖床轉(zhuǎn)速降至160-180r/min；發(fā)酵6d時(shí)，添加滅過(guò)菌的豆粕粉和谷朊粉懸浮液20-30ml；繼續(xù)發(fā)酵至7d，接著將溫度提高到45-50℃，并將發(fā)酵液ph調(diào)節(jié)至7.0-7.5，維持4h，結(jié)束發(fā)酵。測(cè)定發(fā)酵液蛋白酶活力達(dá)到6800-7000u/ml，菊粉酶活力達(dá)到：712-786u/ml。
上述發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為：分別取黃豆粕粉10-20g，谷朊粉10-20g，菊粉5-10g，麩皮粉5-10g，淀粉10-20g，(nh4)2so41g，吐溫-800.5ml，玉米漿15-30g，無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液10ml，混合均勻后，補(bǔ)充去離子水至1000ml；在121℃溫度下滅菌15min。
步驟5、發(fā)酵液酶解雜蛋白
發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液導(dǎo)入酶解罐中，進(jìn)一步向發(fā)酵液中添加麩皮、谷糠、豆粕粉、谷朊粉，使發(fā)酵液變成濃稠狀，調(diào)節(jié)其ph值為5.5，控制溫度為50℃，維持4-6h，中間攪拌2-3次；再次調(diào)節(jié)ph到4.0-7.0，控制溫度為50℃，維持4-6h；得到發(fā)酵酶解料。
步驟6、干燥、粉碎、包裝
酶解結(jié)束后，采取55-65℃低溫烘干的方法對(duì)以上發(fā)酵酶解料干燥處理，然后粉碎過(guò)150-200目篩，成品包裝得到富多肽富蛋白酶飼料添加劑。
實(shí)施例3
用發(fā)酵罐發(fā)酵制備富多肽飼料添加劑(適用于所需發(fā)酵的二級(jí)種子培養(yǎng)液較多的情況)，其制備步驟與實(shí)施例2中的不同之處在于，步驟4中液態(tài)發(fā)酵制備復(fù)合酶的具體操作為：
在15l的發(fā)酵罐中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基8-10l，發(fā)酵罐夾套升溫至95℃，再將蒸汽直接通入發(fā)酵培養(yǎng)基中，121℃滅菌20-30min，將溫度逐漸降至28-32℃，取步驟2所得的二級(jí)種子培養(yǎng)液400-1000ml以火焰法接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐壓為0.05mpa；初始發(fā)酵控制條件為：溫度28-32℃，發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph5.5-6.5，無(wú)菌空氣通風(fēng)比1:0.6-0.8(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速260-300r/min，保持溶氧20-30％；發(fā)酵過(guò)程觀(guān)察泡沫情況，并流加以消泡劑泡敵，消除培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)多泡沫；發(fā)酵2-4d，發(fā)酵溫度降為25-28℃，無(wú)菌空氣通風(fēng)比1:0.4-0.6(v/v)，通過(guò)自動(dòng)流加氨水調(diào)節(jié)ph，控制ph于6.0-6.5；發(fā)酵至3d開(kāi)始補(bǔ)料，每次補(bǔ)料500-1000ml，每隔12h補(bǔ)料一次，共補(bǔ)料2-3次；發(fā)酵6d時(shí)，將發(fā)酵溫度提高至35-40℃，用2mol/l的naoh調(diào)節(jié)發(fā)酵液ph值為6.0-7.0，降低無(wú)菌空氣通風(fēng)比1：0.4-0.6(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速降至200-240r/min；發(fā)酵6d時(shí)，添加滅過(guò)菌的豆粕粉和谷朊粉懸浮液1-2l；繼續(xù)發(fā)酵至7d，接著將溫度提高到45-50℃，并將發(fā)酵液ph調(diào)節(jié)至7.0-7.5，維持4h，結(jié)束發(fā)酵。測(cè)定發(fā)酵液蛋白酶活力達(dá)到6800-7000u/ml，菊粉酶活力達(dá)到：712-786u/ml。
其他步驟同實(shí)施例2。
產(chǎn)品分析
通過(guò)以上發(fā)酵工藝和發(fā)酵液酶解工藝最終大豆粕蛋白和谷朊粉中總蛋白轉(zhuǎn)化為多肽的得率高達(dá)65％。對(duì)制備的多肽粉進(jìn)行分析確定，分子量小于6kda的多肽占總肽量的72.1％，其中分子量介于2-6kda之間的多肽占總肽量的34.5％，有5.62％的多肽分子量在6-20kda之間。
本技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，以上的實(shí)施例僅是用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，而并非用作為對(duì)本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)精神范圍內(nèi)，對(duì)以上所述實(shí)施例的變化、變型都將落在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。